第三节　泌尿系统发生发育的分子生物学机制

一、肾脏发育的分子生物学机制

肾脏是由Wolffian管来源的UB上皮细胞和间介中胚层来源的MM细胞相互诱导发育而成。随着人类遗传性疾病基因突变分析、动物基因敲除和体外组织细胞培养等技术的发展，影响后肾发育过程中调控UB分支形成和肾单位形成的分子学机制的研究取得了很大进展。目前，UB和MM细胞之间相互诱导作用的分子机制，是肾脏发育生物学研究的热点领域。两种细胞之间的相互诱导作用涉及复杂的基因表达程序，多种转录因子、细胞因子、生长因子、细胞外基质和黏附分子等（图1-1）。

（一）肾单位发生的分子调控

1.肾单位祖细胞

后肾，脊椎动物的永久性肾脏，在小鼠妊娠期10.5天左右由IM的后肢发育而来。由MM细胞在UB信号的诱导下分裂增生并聚集成团而形成的CM是一群具有自我更新功能的多能祖细胞，亦称为“肾单位祖细胞”，能表达多种信号因子，如Cited1，Hox11旁系物（Hoxa11、Hoxc11、Hoxd11），Osr1，Pax2，Eya1，Wt1，Sall1，Six1，Six2和GDNF等。Cited1是早期肾单位祖细胞的重要分子标记，但Cited1本身对肾脏的发育并不是必需的。Hoxa11和Hoxd11的缺失可导致输尿管的异位和肾脏的发育不良。Hox11旁系物与Pax2、Eya1一起激活Six2和GDNF的表达，刺激肾单位祖细胞的自我更新和肾管的分支发育。同时，Hox11旁系物调节后肾特异性小管与诱导的CM发生反应，从而形成一个具有正确结构的肾单位。Eya1突变体和Hox11突变体一样，不能诱导UB形成，也不能表达Six2和GDNF，可致后肾缺如。在人体内单纯Eya1基因缺乏可导致支气管-耳-肾综合征和支气管眼综合征。Osr1、Pax2、Wt1、Sall1和Six1中的突变体均可致中肾和后肾发育异常。

除Hox11旁系物外，Foxc1（Mf1）亦参与Pax2-Eya1-Six2调节途径。Foxc1属于叉头/翼螺旋转录基因家族，该家族似乎直接参与Pax2-Eya1-Six2调节途径。基因敲除实验显示该家族通过调节细胞增殖、细胞归属和细胞分化等多个方面在胚胎发育中发挥重要作用。Foxc1和Robo2/Slit2信号通路能将GDNF的表达限制在某个位点，为肾管在MM的发育提供了确切的位置。Foxc1基因缺乏可出现重复肾和输尿管畸形，额外形成的输尿管位于正常输尿管之前，但不能与膀胱连接。

Six2是维持肾单位祖细胞所必需的基因之一，亦是其标志性转录因子。能维持细胞的自我更新及使细胞维持在祖细胞状态并抑制其过早分化。在多种信号通路的诱导下，最终，Six2阳性肾单位祖细胞形成肾单位结构，包括近端和远端小管、足突细胞、鲍曼囊和肾小球。小鼠肾脏中Six2的功能失活导致间充质细胞MET的异位分化，以及CM中肾单位祖细胞的耗竭，导致严重的肾发育不全。

维持肾单位祖细胞存活所需的因素得到了大家普遍关注。成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）通路成为维持祖细胞形态的候选信号。CM中早期肾单位祖细胞中表达一类FGFs（FGF1/9/20），它们通常与FGF受体c亚型结合，促进早期Cited1+肾单位祖细胞的更新，亦有研究发现FGF/EGF受体配体激活RTK以RAS依赖的方式维持早期Cited1+肾单位祖细胞表型。FGF2由UB细胞分泌，体外培养发现重组FGF2能维持培养体系中MM细胞增殖。发育中的肾脏间充质中FGF受体1和2的复合条件失活导致肾发育在E11.5前停止，表明FGF信号在MM发育中起着重要作用。遗传失活研究已经揭示了FGF7、FGF8和FGF10突变体的表型。但是，在FGF2缺失的小鼠模型中未发现相应的肾脏发育异常的表型，提示其他信号通路可能参与这一过程。有报道称，人体中FGF20的突变可导致肾发育不全，FGF9和FGF20同时敲除的小鼠体内MM细胞凋亡增加。目前为止，在肾发育过程中触发FGFs正确表达的分子机制尚不清楚。

Wt1在早期MM中表达，整个肾脏发育过程中持续表达于肾单位祖细胞中，在肾单位形成的近端也有表达。Wt1敲除小鼠出现双侧肾脏发育不全，表现为MM细胞凋亡和UB不能形成。最近有文献指出Wt1缺乏能破坏FGF的功能，导致间充质细胞凋亡，体外培养发现加入重组的FGFs能挽救Wt1缺乏引起的祖细胞凋亡，提示在维持祖细胞存活方面，Wt1可能是FGF信号通路关键调控因子。

人类Sall1基因突变可导致Townes-brocks综合征（肛门-耳-肢体畸形综合征），这是一种常染色体显性遗传病。表现为耳发育不良、多指畸形、肛门闭锁以及肾脏、心脏畸形。Sall1编码一种多锌指转录因子，与核小体重构和去乙酰化酶（NuRD）复合物结合，该因子是小鼠正常肾脏发育所必需的。它在肾单位祖细胞和CM衍生的分化结构如管前聚集物（pretubular aggregates，PTA）、肾小泡（renal vesicle，RV）、Comma型小体和S型小体中高表达。Sall1控制着肾单位祖细胞自我更新和分化之间的平衡。在Sall1敲除小鼠中，Six2+肾单位祖细胞由于快速分化为肾小泡而耗尽，这会导致生长停滞和肾脏严重发育不良；在Six2+细胞中条件删除Sall1产生了类似的表型，表明细胞自主抑制肾单位祖细胞的分化需要Sall1。有文献报道在维持肾单位祖细胞的自我更新方面需要NuRD-特异性成分Mi2-β（Chd4）的参与。

2.肾单位的形成

肾单位的大多数组成部分，包括肾小球、近端小管、髓袢、远端小管和连接小管，都来自肾单位祖细胞。而肾小球的系膜细胞和内皮细胞来源于不同的祖细胞。成熟肾单位的发育分为四个阶段：第1阶段，上皮性肾小泡形成；第2阶段，展开为Comma型和S型小体；第3阶段，在近端形成肾单位血管球；第4阶段，成熟为有功能的肾单位。目前为止，调控肾单位和输尿管端部融合进而使两个上皮性的管腔连接的具体机制尚不清楚。

脊椎动物Pax基因家族是基于果蝇部分基因的序列同源性确定的，这些基因编码一个保守的DNA结合域，称为配对框。Pax2基因对于肾脏和生殖器官的发育至关重要，这两者都来源于间介中胚层。Pax2与相关基因Pax8和同源域蛋白Lhx1一起，是间介中胚层最早的标记之一。Pax2阳性间介中胚层产生肾管，或称Wolffian管。Wolffian管的一个分支称为UB，其周围的后肾间充质称为MM。当UB侵入MM并传递诱导信号（如Wnt9b）促进UB尖端周围MM聚集形成CM时，肾脏发育就开始了。

Wnt9b由UB上皮分泌，诱导CM祖细胞分化为上皮性RV细胞。新形成的RV经过极化和伸长，形成Comma型和S型小体。后者与UB端上皮融合形成肾单位。肾脏发育过程中Pax2在Wolffian管、UB、未被诱导的MM、CM、Comma型小体均有表达，在S型小体的表达下降，仅在邻近分支UB的部位表达，成熟肾单位其表达消失。在Pax2-/-等位基因缺失的小鼠体内，肾脏和生殖道完全缺失，进一步分析发现胚胎发育过程中Wolffian管仅部分发育，而UB不能形成，可能与Pax2缺失导致MM不能正常表达GDNF有关。人体内，已经在肾缺损综合征患者中发现了多个Pax2突变，其特征是发育不良、发育不全和膀胱输尿管反流。

在间充质细胞-上皮转化过程中，基质蛋白和细胞间黏附分子也发生了变化，表现为间充质特异性的基质蛋白（Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白）停止表达，取而代之的是上皮基质蛋白（Ⅳ型胶原蛋白和Ⅴ型胶原蛋白、层粘连蛋白α、硫酸肝素蛋白聚糖、E-cadherin、α6整合素）等，随着肾小球足细胞发育成熟，逐渐出现podocalyxin、peanut lectin等足细胞标志蛋白。

（1）肾小泡的形成：

哺乳动物Wnt家族包括19种脂质修饰的分泌糖蛋白。其中有几种调节哺乳动物肾脏发育的不同方面。Wnt9b在外生的UB的上皮细胞中均匀表达，并诱导MM细胞形成RV，基因突变已经证明Wnt9b对于肾单位祖细胞的特异性分化或UB的生长不是必需的，但是在诱导MM形成RV过程中是必需的。为保证RV的正常发育，Wnt9b信号通路在管前聚集物（PTA）中激活二次信号FGF8和第二个Wnt成员Wnt4的表达。基因分析显示Wnt4的活化离不开FGF8的支持，而FGF8的表达及其自身的活化以及转录调节因子LIM homebox 1（Lhx1）的重新激活也离不开Wnt4信号通路。这两个基因的遗传分析表明，FGF8位于Wnt4的上游。Wnt4通过自分泌或旁分泌的形式作用于压缩的间充质细胞，促使其上皮化，并协调Pax2、Pax8一起引导层粘连蛋白α、α6整合素、E-cadherin基因表达，刺激间充质向上皮分化，进一步形成RVs；同时重新激活Lhx1参与肾单位远端的发育。Wnt9b和Wnt4的早期诱导是由典型的Wnt信号通路调控β-catenin磷酸化实现的。从遗传学角度来说，在PTA中β-catenin的高表达可以模拟Lhx1行动，然而典型通路激活能抑制MET。由此，有人推测Wnt4在上皮化的最后阶段可能采用了另一种机制，这一假设得到了钙/NFAT通路分析的支持。基因敲除实验显示Wnt4-/-的大鼠UB诱导下间充质可以形成聚集，但不能形成RV。

BMP7属于TGF-β超家族成员之一。间充质细胞开始聚集后，主要在CM分化的肾单位祖细胞和分支早期的UB上皮中表达。基因敲除研究发现，在没有BMP7的情况下，间充质细胞大量凋亡，提示BMP7在维持肾单位祖细胞群起着不可或缺的作用。此外，E12.5后BMP7的缺失诱导肾单位祖细胞的过早分化，表明BMP7活性对祖细胞分化也很重要。体外实验发现，BMP7可以诱导MM组织形成肾小管上皮细胞结构。BMP7基因敲除的突变小鼠体内，UB分支明显减少，且肾单位的数量明显减少，提示BMP7在肾单位发育过程中发挥重要作用。

（2）近端小管、髓袢和远端小管的发育：

RV形成后，Wnt4和Lef1在RV远端呈极化表达模式，提示Wnt信号梯度可能是调控早期RV极性的因素之一。但是，极化的Notch信号在近端肾单位诱导中的关键作用得到了很好的研究。MM中特异性敲除Notch2后仅形成远端上皮结构，表明Notch2信号对近端肾单位（足细胞和近端小管）的发育至关重要。三个Notch配体——Dll1、Lfng和Jag1很好地位于发育中的肾单位的远端（早期RV）或中间区域（S型小体期），以调节近端Notch信号。与Dll作用相一致，Dll亚等位基因可以导致肾单位数目减少和近端小管缺失。

肾单位祖细胞和PTA中去除Hnf1b（一种含有转录因子的POU结构域）可以出现通过短管连接到集合管的扩张的肾小球，此肾小球中肾小管近端小管和髓袢完全缺如。同时，研究发现Notch配体Dll1、Lfng和Jag1的表达随着Hnf1b的缺失而减少。此外，Hnf1b与Dll1和Lfng的启动子结合，提示Hnf1b具有直接调控作用。Hnf1b还与在S型小体内侧段表达的转录调控基因Irx1和Irx2的启动子相关，这两种转录调控基因在Hnf1b突变体的分化结构中表达水平下降。这些数据表明，Hnf1b下游的Irx1/2可能也发挥了作用。

与Notch信号在近端肾单位的作用相反，Lhx1、Pou3f3（Brn1）和Lgr5对远端肾单位的发育起着重要作用。Lhx1、Dll1和转录因子Brn1一起在远端RV中表达。特异性去除Lhx1的MM形成的RV缺乏这些远端极性标记物，尽管远端仍表达Wnt4。Lhx1突变体中缺乏正常的S型小体。Brn1突变体中，尽管肾脏有正常的肾小球和近端小管计数，但是髓袢的延伸和分化以及远端小管的分化，包括位于这一节的特殊的盐敏感细胞致密斑的分化均严重减少。在哺乳动物肾脏中，Lgr5在早期肾单位祖细胞群中不表达，而是在Comma型和S型小体的远端被激活。命运图谱研究显示，这些细胞产生了髓袢（亨利环）的增厚环路和远曲小管。与其他器官不同，Lgr5的表达仅限于发育中的肾脏，在成熟肾单位中丢失，在成人肾脏中未被发现。目前的数据表明，如果Lgr5在肾脏中有功能，它可能局限于内侧和/或远端小管的发育。

（3）肾小球的发育：

肾单位的过滤单位，称为肾小球。由近端RV发展而来。RV形成后，在连续的内陷作用下形成S型小体，形成包括壁层和脏层肾小球上皮细胞在内的几种不同的肾单位细胞类型。当内部血管形成后，壁层和脏层上皮细胞形成肾小球。脏层上皮细胞形成足细胞，而壁层上皮细胞形成鲍曼囊壁层。足细胞成熟需要近端RV中Wt1的参与。Notch转录中介Rbpj可直接与足细胞必需因子Wt1和Foxc2结合，调控足细胞发育所必需的基因在体外表达。同时，Wt1可能也可以通过直接抑制近端Pax2的活性来促进足细胞的发育。

肾小球毛细血管的形成依赖于内皮细胞、足细胞和系膜细胞的协同作用。肾小球毛细血管形成始于S型小体阶段，并且其发育必须与足细胞发育相一致。RV形成后，鲍曼囊的壁层上皮细胞表达高水平的Vegfa，可以从周围的间质吸引成血管细胞进入肾小球裂隙，迁徙的内皮细胞随着肾小球的生长经历有丝分裂，分化增殖为毛细血管，上皮足细胞和血管内皮细胞共同产生细胞外基质成分，形成基底膜（GBM），其后系膜细胞亦被招募入肾小球。系膜细胞发生可能来源于后肾内特定的MM细胞，PDGFB/PDGFB受体通路能控制系膜细胞募集。系膜细胞有助于毛细血管袢的形成和固定。在毛细血管形成阶段，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管生成素-1发挥着重要作用。基因敲除的结果证实，VEGF及其受体参与脉管发生，血管生成素-1及其受体参与血管发生。

（4）肾单位的成熟：

肾单位发育成熟是指完全分化的上皮细胞为适应其排泄最终代谢产物、毒物，维持水电解质平衡的功能而具有的较胚胎期上皮细胞更为复杂的膜形态，包括基底侧的绒毛、膜顶端的微绒毛以及大量表达的转运蛋白等。生后肾脏内部结构/功能的完善与成熟需要相当长的一段时间。新生儿体内肾小球的平均直径只有成人的1/3～1/2，肾小管平均长度相当于成人的1/10。这种结构上的差异在出生后12～14个月消失，因此，肾脏的各种生理功能在1～1岁半后才达到成人水平。

（二）集合系统发育的分子调控

多种MM细胞分泌的信号参与UB的发生及分支形成的调控，包括转录因子Pax2、Wt1、Lim1、多肽因子GDNF等。UB受MM细胞诱导以二叉分支的形式逐渐形成肾盂、肾盏、输尿管和集合管系统。

1.输尿管芽的形成和后肾间充质的诱导

Pax2参与胚胎肾脏各个发育阶段的调控。在肾脏发育的早期，Pax2通过激活未诱导的间充质表达GDNF而协调UB的出芽和定位，并调节随后的UB分支形成。有研究发现许多已知的肾脏发育调节因子，如Gata3、GDNF、c-Ret、Six2、Sall1和Lhx1，以及与糖基化、细胞膜、细胞-细胞信号和细胞黏附相关的基因和蛋白质，都可能受间介中胚层及其早期衍生物（肾管、中肾和后肾间充质）中Pax2的调控。最近又有研究指出在前肾和中肾发育过程中，由Pax2、Gata3和Lhx1组成的核心转录网络调控肾脏发育下游效应因子的表达。

调控原始UB生长和分支的关键因子GDNF由MM分泌，而其受体Ret分布于UB上皮细胞上。MM分泌的GDNF激活WD上的Gfrα1/Ret受体酪氨酸激酶复合体，同时启动了一个信号级联反应，表现为Ret受体表达上调，从而触发Ret阳性细胞从WD沿着GDNF信号生长。在E10～10.5，WD在高度受限的MM中广泛肿胀。在E11，从肿胀的WD最尾部长出一个芽，背朝着MM方向生长，形成UB。UB是一个上皮管，有一个连续的腔，周围有基底膜。最终，UB的伸长导致分化为两种不同的结构，一种是UB远端分支形成集合管，另一种是UB主干形成输尿管和肾盂。上述任何信号的异常或丢失，都会导致小鼠肾脏发育完全失败和肾脏发育不全。

Wilms肿瘤1基因（Wilms' tumour 1 gene，Wt1）编码一种转录因子。该转录因子既是肿瘤抑制因子，又是肾脏器官生成的关键调控因子。作为一种锌指转录因子，其编码的Wt1蛋白的表达在时间和空间上受到严格的调控，在哺乳动物胚胎泌尿生殖系统的器官形成和功能维护中起着重要作用。Wt1在诱导前的MM表达水平较低，在压缩间充质、肾小泡、Comma型小体、S型小体近端形成足细胞部分表达水平较高，成熟肾单位中仅在足细胞和鲍曼囊中有表达。在肾脏发育早期，Wt1作为UB形成的诱导信号，同时亦为间充质细胞接受UB反馈信号的受体进而维持间充质的存活。当Wt1的表达发生障碍时，可导致Wilm肿瘤、Frasier综合征、Denys-Drash综合征、孤立的弥漫性系膜硬化和特发性的持续性肾病综合征。

2.控制输尿管芽生长和分支的分子信号

一个复杂的信号网络控制着UB的生长和分支。肾脏发育领域的第一个和重要的发现之一就是揭露了MM和UB之间的相互作用：MM可以诱导UB的生长和分支，UB可以诱导MM通过MET参与肾发育。这些过程受到许多不同的刺激或抑制信号的调节。MM细胞释放促进UB尖端生长和分支的因子。围绕UB主干的肾单位上皮和基质细胞促进其延伸，但抑制其分支。一些促进UB生长和分支的因子如GDNF、FGF、BMPs等也有防止UB出现异位芽和输尿管外芽异常分裂的作用。

（1）GDNF-Ret信号系统：

在UB形成和分支发育过程中均发挥着重要作用。GDNF或Ret基因失活均可导致UB形成及分支障碍，导致肾脏不能发育或发育不良。GDNF是MM分泌的一种肽类生长因子，属于TGF-β超家族，在环绕UB的间充质中表达，是Ret的配体。Ret是一种受体酪氨酸激酶，表达于UB顶端部位。Ret可以通过激活多条信号通路如ERK MAP激酶，PI3K和PLCγ通路参与UB的分支过程。GDNF-Ret信号通路的重要功能之一是上调UB尖端Etv4、Etv5、Met、Mmp1、Spry、Wnt11等不同靶基因的表达。然而，只有ETS转录因子Etv4和Etv5是UB从肾管中生长所必需的。

此外，基质细胞表达的维生素A-视黄醛酸受体RARα/RARβ2及转录因子Foxd1（BF2）对于维持UB分支顶端Ret的表达也发挥至关重要的作用。实验模型发现，RARα/RARβ2、Foxd1突变，可影响Ret的表达，导致UB分支明显减少，进而出现肾单位形成减少、肾脏体积缩小的表型。

（2）FGF信号通路：

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）是由基质细胞分泌的一种生长因子，通过与Fgfr1和Fgfr2两种受体结合传递信号诱导UB的形成。这两种受体表达于UB和MM。Fgfr2在Wolffian管各部位均有表达，维持Wolffian管的形态和功能。其中一种受体的缺失不会导致肾脏畸形，但两者的缺失会导致肾脏发育不全。两者受体缺失也可导致Pax2、Six2和Sall1的缺失，即使Eya1、Six1和Wt1仍然表达。同时，研究表明，FGF-7、FGF-10基因缺失的大鼠可出现髓质发育障碍，表现为肾乳头发育不良。

MM中FGF信号通过一种未知的机制阻止了异位UB的形成，目前，BMP4对UB分支和GDNF功能的强烈抑制从而阻止输尿管异位芽的生长和输尿管外芽的分裂已被报道。

（3）Six1和Sall1信号通路：

Six1是一种同源盒蛋白，在未诱导的MM中表达，对早期肾脏发育至关重要。Sall1不仅表达于肾单位祖细胞和CM衍生的分化结构中，控制着肾单位祖细胞自我更新和分化之间的平衡，亦表达于环绕UB的间充质。Sall1依赖于Six1存在，如果Six1缺失，则Sall1也不表达。Sall1缺失则导致UB不能从Wolffian管中形成，进而导致肾缺如。

（4）Wnt信号通路：

哺乳动物Wnt家族包括19种脂质修饰的分泌糖蛋白。遗传、生物化学和培养实验表明，典型的Wnt信号通路是启动哺乳动物肾脏发育的中心通路。Wnts在UB（Wnt5a、-5b、-6、-9b和-11）以及MM（Wnt2b、-4和-5a）中均有表达。Wnt信号通路在诱导和调节肾发育中发挥重要作用。

从E13.5开始，Wnt7b在集合管上皮细胞中表达，它在皮质-髓质轴的形成中起着至关重要的作用。Wnt5a是最近发现的参与肾脏发育的Wnt家族成员，许多肾癌及其他疾病可能与Wnt5a的表达缺失有关。Wnt5a突变导致的Robinow综合征是众所周知的，表现为短肢侏儒症、脊柱节段性缺失、头面和外生殖器的发育畸形。

在胚胎发育后期，UB的主干伸长发育成肾髓质和乳头的集合管，而有丝分裂纺锤体的取向是集合管伸长的重要机制。有报道称Wnt7b和Wnt9b可以调控细胞分裂过程。如果缺乏Wnt7b，可以观察到小鼠的肾髓质和肾盂发育失败，形成异常短而宽的集合管。Wnt9b也表达于UB的主干上皮细胞中，在胎儿晚期和出生后的集合管发育过程中，参与调控有丝分裂细胞的方向。非典型Wnt/PCP信号通路通过RHO和JNK途径参与该过程的调控。生存信号在髓质和乳头集合管的形成过程中具有重要意义。这些信号包括Wnt7b、Hgf、Egf和层粘连蛋白。如果小鼠乳头集合管中Wnt7b或Egf缺失，则它们就会死亡。同时，ECM中层粘连蛋白的存在通过维持Wnt7b的正常表达，参与促进集合管细胞的存活。

（5）金属蛋白酶：

UB分支侵入MM过程中，消化溶解其分支顶端ECM中的金属蛋白酶活性，如MMP2/9（metalloproteases2/9）和尿激酶等，对于UB分支形态的发育至关重要。体外实验证实，抗MMP9中和抗体可抑制培养肾脏的UB形态发育；组织金属蛋白酶抑制剂1/2（tissue inhibitor of metalloproteases 1/2，TIMP1/2）及具有蛋白酶活性的化合物在培养的肾脏及UB中均明显地抑制UB分支生长及形态发育。

3.输尿管芽分支发育的成熟及终止

到目前为止，影响UB分支发育成熟及终止的机制尚不明确。随着UB分支不断延伸进入外周皮质，其分支顶端Ret表达开始下降，被诱导分化的MM分泌GDNF减少，转录因子Pax2表达降低，导致促进上皮细胞生长的信号减弱，细胞增生速率减慢；另一方面，分化成熟肾小管和基质细胞来源的负反馈调节信号可能逐渐增强，最后导致UB分支逐渐减慢，直至停止。体外器官培养结果显示，TGF-β超家族成员（如TGF-β1、BMP2、BMP4和activin）对于胚胎肾脏及其细胞株的生长（特别是UB）均具有明显的抑制作用。但是，TGF-β1和activin敲除小鼠体内没有发现明显的肾脏发育异常（表1-1）。

二、膀胱发育的分子生物学机制

膀胱是通过泌尿生殖窦内胚层和间介中胚层之间的间充质-上皮相互作用而形成的。内胚层产生膀胱上皮，周围的间充质发育为中间固有层和外层平滑肌层。唯一的例外是膀胱的基底部，即三角区。在这里中肾导管的尾端及其输尿管芽逐渐并入膀胱壁。成熟膀胱的组织学结构包括：膀胱上皮、基底膜、固有层（主要为结构Ⅰ型胶原、结构Ⅲ型胶原和成纤维细胞）、逼尿肌层（逼尿肌平滑肌细胞和结构Ⅰ型胶原、结构Ⅲ型胶原）和浆膜层。目前，在膀胱发育过程中，上皮细胞和间充质相互作用的具体机制尚不完全清楚。但是，同肾脏发育一样，多种细胞因子、转录因子和细胞外基质参与其中。

（一）Shh/BMP4信号通路

Shh（sonic hedgehog）由膀胱上皮产生，是驱动间充质分化和生长的关键因子，在膀胱发育早期表达。Shh的浓度梯度在膀胱肌肉组织的发育中尤为重要，表现为Shh能通过突然的开/闭浓度梯度诱导间充质向平滑肌分化。虽说平滑肌的分化离不开Shh，但是，不同浓度的Shh对平滑肌的作用是不同的——高浓度的Shh抑制平滑肌的分化，低浓度的Shh诱导平滑肌的分化。Shh一方面通过与其受体Ptc结合促进平滑肌的分化，另一方面通过诱导其靶标转录因子Gli2表达，上调靠近膀胱上皮的间充质细胞表达BMP4，减少平滑肌的分化。

（二）Smads/TGF-β/BMP4信号通路

TGF-β超家族成员在一系列关键生物活动中发挥重要作用，包括增殖、分化、迁移、调节多种细胞类型的遗传分化方向和凋亡等。已经证实，TGF-β在多方面参与膀胱发育过程：①调节尿路上皮和膀胱平滑肌细胞的生长和分化；②调节胶原蛋白的表达；③调节纤维化细胞表型，如调节膀胱纤维化的结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）。

BMP4是TGF-β超家族成员之一。可由Shh诱导其周围的间充质细胞表达。BMP4参与间充质细胞向输尿管上皮周围平滑肌层（SM层）的分化。有研究发现，与TGF-β一样，在小鼠妊娠期14.5天，BMP4在肌层间质和固有层均有表达，这就提出了BMP4和TGF-β共同调控平滑肌形成和分化的可能性，因为这两种途径都参与了细胞增殖、分化、凋亡和迁移。

Smads家族蛋白在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起关键作用。哺乳动物中有8个已知的Smad家族成员，根据其功能分为受体活化型Smad（R-Smads）、共同通路型Smad（Co-Smads）和抑制型Smad（I-Smads）。一部分R-Smads（Smad1、Smad5和Smad8）通过BMP信号通路传递信号，另一部分R-Smads（Smad2和Smad3）通过TGF-β、激活素和节点信号通路介导信号传递。Co-Smad包括Smad4，是TGF-β家族各类信号传导过程中共同需要的介质。I-Smads包括Smad 6和Smad 7，可与激活的Ⅰ型受体结合，抑制或调节TGF-β家族的信号转导。

研究发现，TGF-β和BMP4通过胞质信号转换器Smads发挥作用，而每个Smad在膀胱发育过程中表现出不同的表达模式。Smad1和Smad5可能通过BMP4信号通路参与维持膀胱上皮/尿路上皮的特性。Smad2和Smad3可能在调控平滑肌分化的多条信号通路如TGF-β、Shh和BMP4中存在交叉作用。Smad4是调节Smads转位到细胞核所必需的，并且是TGF-β、BMP和激活素等Smad依赖的信号传导途径的共同中介。抑制性Smad中，Smad7和Smad6分别主要通过抑制TGF-β和BMP信号通路抑制生长停滞和细胞凋亡。

（三）Fgr2

据我们所知，在膀胱发育过程中，Fgfr2是Shh和TGF-β超家族信号通路之外的第三个已知信号通路。Wolffian管基质中Fgfr2缺失导致Shh活性增强，同时Boc和Cdo水平增加，最终，这些分子的变化导致了膀胱平滑肌组成成分的异常，表现为平滑肌水平下降、胶原蛋白水平增加，从而导致排尿功能障碍、膀胱收缩力降低、顺应性下降。

（四）细胞外基质

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是蛋白质、蛋白聚糖和黏多糖组成的结构支架，为膀胱细胞提供支持和信号传递。

1.成熟膀胱组织中的细胞外基质成分

（1）膀胱上皮：

在保护膀胱不受尿液损害以及储存尿液等方面发挥重要作用。膀胱上皮对各种尿液有毒成分和细菌感染具有保护作用和不透水性，与覆盖在尿路上皮细胞上的黏多糖（主要是软骨素和硫酸肝素）和骨桥蛋白有关。同时，尿激酶如PP5和MMP7能维持膀胱上皮的周期性脱落并有助于防止细菌感染。

（2）基底膜：

位于上皮和内皮之下，也围绕着结缔组织细胞，如成纤维细胞和平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMC），它的结构高度保守，在蠕虫、果蝇和人体中均由四种基本成分组成：层粘连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、巢蛋白和基底膜聚糖。层粘连蛋白黏附并结合细胞表面的受体，包括整合素。然后它们通过结合Ⅳ型胶原进一步与巢蛋白和基底膜聚糖交叉连接。Ⅳ型胶原通过与黏附性胶原（如Ⅶ型和Ⅸ型）与结构胶原（Ⅰ型和Ⅲ型）相连。相比之下，纤维连接蛋白进化较晚，仅存在于脊椎动物的基底膜中。

（3）固有层：

是膀胱上皮层和间充质层之间的一道屏障。它包含成纤维细胞、神经纤维、淋巴管和血管，主要由Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅶ型胶原蛋白、层粘连蛋白和弹性纤维组成。如果固有层受损，将影响神经纤维对力学变化的感应能力。

（4）黏膜下层：

黏膜下层基质中含有丰富的生长因子和胶原，包括Ⅰ～Ⅳ型胶原蛋白、VEGF、BMP4、PDGF-BB、KGF、TGF-β1、IGF、bFGF、EGF和TGF-α。同时，也含有丰富的糖蛋白和透明质酸。多种生长因子可能有助于刺激该部位的细胞增殖。

（5）逼尿肌层：

逼尿肌或外肌层分为三层，由Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白、层粘连蛋白和骨桥蛋白覆盖并整合而成。也有一部分Ⅵ型和Ⅶ型微纤维胶原。平滑肌束和外膜周围有透明质酸。角膜上皮组织成复杂的褶皱，在生理性充盈和排空过程中促进膀胱的扩张和收缩。膀胱平滑肌细胞能产生Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原蛋白和纤维连接蛋白。

2.参与ECM细胞相互作用的可能分子机制

（1）金属蛋白酶（metalloproteases，MMP）：

是锌依赖的内肽酶。作为前肽分泌，可被MMP1、MT-MMP、丝氨酸蛋白酶和其他多种酶消化成有活性的形式。MMPs有多种功能，包括暴露周围基质中的促增殖新表位以及松动基质之间的连接，后者可以增加膀胱的顺应性和扩大膀胱容量。MMP对体内膀胱功能的影响尚未被明确描述。目前发现与膀胱发育有关的有MMP1、MMP2、MMP7、MMP9和MMP28等。

（2）ADAMTs：

是新发现的一类Zn2+依赖的分泌型金属蛋白酶。ADAMT-2和ADAMT-3分别在发育的膀胱壁黏膜和上皮下（固有层）区域表达，可以通过影响Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型胶原的合成导致膀胱顺应性的改变。

（3）整合素：

是一类普遍存在于脊椎动物细胞表面，依赖于Ca2+或Mg2+的异亲型细胞黏附分子。介导细胞和细胞之间以及细胞和ECM之间的相互识别和黏附，具有联系细胞外部与细胞内部结构的作用。它们通过与FAK、Rho和RhoK的相互作用连接ECM、细胞骨架和细胞核，是细胞和ECM之间的关键介质。整合素α6β4是膀胱上皮中的主要黏附介质，而在平滑肌中，以整合素αvβ3、α5β1、α3、α2和α1为主。整合素在膀胱平滑肌细胞的发育和菌株诱导的增殖反应中起着重要作用。

（4）非整合素样ECM受体：

非整合素ECM受体在膀胱发育中的作用才刚刚开始被重视。它们包括透明质酸受体CD44、Toll样受体4（TLR4）和透明质酸介导的运动受体（receptor for hyaluronan-mediated motility，RHAMM）。整合素和非整合素ECM受体与基质酶相互作用参与生长因子的释放和激活。CD44与透明质酸和硫酸肝素蛋白聚糖结合可以影响HB-EGF的配体结合和受体激活。CD44可与胶原蛋白、纤维连接蛋白和骨桥蛋白形成复合物，并介导MMP依赖的TGFβ的激活。TLR4可与硫酸肝素片段、纤维蛋白原和许多其他ECM片段，包括透明质酸片段相互作用。膀胱扩张损伤中RHAMM表达增多，其阻断可抑制应变诱导的Ⅰ、Ⅲ和Ⅶ胶原mRNA的表达。

（5）赖氨酰氧化酶：

赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）是稳定细胞外基质的关键酶。主要功能是调节细胞黏附、迁移及基因转录等。人表皮生长因子样结构域蛋白7、炎症介质和O₂的水平可以调节LOX的活性。在生理条件下，LOX和其他类似LOX的蛋白质通过活化单胺氧化酶介导胶原纤维和弹性蛋白中规则赖氨酸的交联形成。尽管LOX诱导的交叉连接是如何影响膀胱ECM组成和细胞表型的，目前还不清楚，但是如果没有LOX家族的蛋白质，细胞外基质的关键结构成分胶原蛋白和弹性蛋白就无法正常交联，从而导致膀胱过度膨胀，失去有效收缩的能力。

（6）其他ECM组成成分：

细胞黏合素C（tenascin-C）参与血管平滑肌细胞的血管生成和增殖，当膀胱平滑肌细胞张力增大时，其水平可升高，同时，层粘连蛋白B1、B2、纺锤蛋白、血小板反应蛋白-1、软骨素蛋白多糖、硒蛋白P和EFEMP1的表达均增多，这些蛋白在这一过程中可能发挥特定的作用，但是，目前该具体机制尚未阐明。

其他如DDR2和Lgal1在发育中的膀胱逼尿肌中有表达，但是目前对这两种分子的功能研究仅限于膀胱外的部位。一些GAGs如肝素、透明质酸、皮肤硫酸盐和HAPlN1（透明质酸和蛋白多糖连接蛋白1）在膀胱黏膜有表达，但在膀胱发育过程中的作用目前尚不明确。

综上所述，泌尿系统发育是由复杂的基因调控网络协调的，多种分子信号通路参与其中。阐明泌尿系统发育过程中复杂的分子信号通路有助于揭示引起先天性肾脏和泌尿道发育畸形的分子机制，为肾脏病的诊治提供新的思路。

（王墨　杨宝辉）